邻位连接PLA-学习笔记

fengzhrng

近期需要跟合作者探讨PLA的图像处理分析，所以记录一下PLA的相关知识作为了解，欢迎补充和探讨，请勿转载。

蛋白相关的研究方法包括western、sandwish ELISA、Co-IP、Y2H（酵母双杂交）、FRET等等。其中western还有Co-IP等等都是利用抗体来检测目标蛋白，但是抗体在Kd较低蛋白浓度高的情况下可能会存在着交叉反应以及非特异性吸附等问题，直接对蛋白进行标记可以解决这些问题，适用于基础研究，但是这种方法不能被用于临床研究，因此有了PLA的方法。[1]
PLA全称为proximity ligation assay，PLA扩展了传统的免疫分析，可以实现内源蛋白的原位检测，蛋白相互作用，胞外分子以及翻译后修饰，特异性和灵敏度都很高。其主要的想法是利用DNA体外扩增的优势，利用DNA来反映靶蛋白及其数量[2] ，实现仅利用少数细胞、亚细胞事件，甚至是瞬态或弱相互作用，都可以在原位显示，并且可以区分细胞亚群。 [3]

原理

实验分为几个步骤[4]

• 一抗识别靶标蛋白
  
• 带有affinity probe/DNA adapter（PLA probe）标记的二抗结合一抗（引入DNA）
  
• 邻位的蛋白靠近后，PLA probes形成环状结构（临近DNA成环）
  
• DNA聚合酶利用PLA 作为primer对DNA进行复制（高效复制DNA）
  
• 加入荧光标记的反义oligonucleotide进行荧光标记，从而实现对临近蛋白的标记（引入荧光，实现信号扩增）
  

应用

in situ PLA（isPLA）被用于抗体的验证
rISH-PLA被用于研究蛋白与RNA间的关系
multiplex PLA实现同时检测多个蛋白复合物

分析

非生信
Cell profiler [5]
PLA-github https://github.com/dcluet/PLA
参考

• ^Proximity ligation assays: arecent addition to the proteomics toolboxhttps://www.tandfonline.com/doi/epdf/10.1586/epr.10.10?needAccess=true&role=button
  
• ^Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assayshttps://www.nature.com/articles/nbt0502-473
  
• ^Proximity ligation assayhttps://en.wikipedia.org/wiki/Proximity_ligation_assay
  
• ^merck-PLAhttps://www.sigmaaldrich.com/DE/en/technical-documents/technical-article/protein-biology/protein-and-nucleic-acid-interactions/how-pla-works
  
• ^cellprofiler_examplehttps://github.com/tischi/cellprofiler-practical-NeuBIAS-Lisbon-2017/blob/master/practical-handout.md