小核酸药物及递送系统梳理

北京愤怒羔羊猩

小核酸药物开始向常见病布局，基于核酸的疗法正在给制药领域带来革命性的变化。
核酸疗法可以针对疾病的遗传基因，作用于蛋白质合成上游，而不是下游。核酸药物本身在体内的稳定性较低，且易被迅速清除。用于核酸输送的递送系统为解决这些难点提供了可能。目前ASOs、mRNA、siRNA等核酸疗法已被广泛用于调节DNA或RNA的表达，基因疗法与纳米级递送系统相结合，显著拓宽了这些分子的治疗和生物医学应用，推动着行业发展。
一.从高中生物开始科普

1.核酸及mRNA的定义

核酸是所有生命体遗传信息的载体，包括脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA两大类。mRNA，即信使RNA，信使核糖核酸，在DNA的基础上发展而来。

• 1953年，Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构，DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息。
  
• 1960年，Fran ois Jacob和Matthew Meselson通过噬菌体感染大肠杆菌确定了细胞内存在一种将细胞核里的遗传信息转移到细胞质的机制。
  
• 1961年，他们提出了mRNA假说：细胞内应该有一类充当信使的RNA分子，它们由许多不同的mRNA分子组成，每一种mRNA在核苷酸序列与DNA上的基因序列互补，然后被运输到细胞质为蛋白质合成提供模板。在一种蛋白质合成结束以后，mRNA将离开核糖体，为其他的mRNAs“让路”。
  

2.中心法则

中心法则是分子生物学的重要概念，甚至可以说是核心原则。DNA要将自身的遗传信息表达出来，首先要将基因序列复制给单链的mRNA，这一过程称为转录。然后mRNA再通过细胞质内的核糖体处翻译成最终的蛋白质产物，mRNA充当信使角色，将遗传信息从细胞核内的DNA传递到细胞质中的核糖体。最终翻译成我们需要的蛋白质，比如治疗新冠，需要S棘突蛋白质抗原。某些特殊情况下，RNA也可以通过逆转录成为DNA。
二.核酸药物的定义和分类

1.核酸药物定义和分类

随着分子生物学的发展，人们发现除编码蛋白质的核酸序列外，存在大量非编码序列对人体生命活动发挥着重要调控作用，如启动子、增强子、核酶等。利用核酸分子的翻译或调控功能，作为干预疾病的药物，即为核酸药物。与小分子药物和抗体药物相比，核酸药物能从源头进行干预，抑制疾病相关基因表达为病理性蛋白，具有“治本”的特点。
核酸药物可以主要分为小核酸药物和mRNA两大类，小核酸药物，即寡核苷酸药物，包括反义核酸(ASO)、小干扰核酸(siRNA)、微小RNA(miRNA)、核酸适配体(Aptamer)及其他。mRNA产品可分为mRNA疫苗和mRNA药物。



核酸药物的分类（前四项均为小核酸药物）

• 反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)，是一种单链寡核苷酸分子，长度在12-30bp之间，一般是DNA和RNA的杂合分子，分子量比较小，最初科学家们的想法非常简单，想通过碱基配对来封堵DNA或RNA的翻译和转录，超出大家预期的是，ASO还可以招募RNA酶、特异性降解靶向的mRNA、干扰pre-RNA的剪切并且通过调控翻译间接增强某些蛋白的表达，这些功能都可以被应用于针对不同靶点设计不同的ASO药物。目前，已有8款ASO药物被批准上市，全球有超过50个ASO药物在临床阶段，覆盖领域包括：中枢神经系统、抗感染、心血管、肿瘤等。Ionis是这个领域的头部企业，有非常多管线在临床中。
  
• siRNA药物，治疗机制是基于RNA干扰机理，这个现象是降解mRNA以后的转录后的基因沉默，RNA干扰现象高度保守，在很多真核生物中被发现。siRNA是人为合成的长度在15-30个bp之间的双链RNA分子，短于21bp的siRNA和TRBP整体结合，进而与Ago 2结合，形成沉默复合体的前体：pre-RISC。之后，siRNA中的Guide strand，即负链RNA，被选择装载到pre-RISC中，正链RNA被降解，从而形成成熟的RISC，成熟RISC会与靶向的mRNA蛋白结合，RISC中的Ago 2蛋白具有核酸外切酶的活性，可以切割mRNA，导致基因表达沉默。siRNA药物是人工合成的小片段。
  
• miRNA药物，其机制是部分链的配对，与siRNA不同，miRNA只是在种子区的几个碱基进行配对，所以miRNA可以调控多个分子，siRNA有可能进入miRNA的途径，导致脱靶。
  
• 核酸适配体(Aptamer)，是折叠成独特的三维结构的短单链寡核苷酸。可利用其三维结构特异性结合较大范围的目标，包括蛋白质、小分子、金属离子、病毒、细菌和全细胞，其高特异性和结合亲和力可达到抗体水平。与抗体相比，核酸适配体具有许多优势，例如体外筛选快速、可无细胞化学合成以及体积小，具有较低免疫原性和较强组织穿透力。
  

各类小核酸药物作用机制及优劣势比较

2.小核酸药物的发展

小核酸药物从基础研究到成药有着漫长的过程：

• 1960-2000年的40年是机制发现阶段，在科学家研究反应核酸药物的过程中，核酸修饰方面有很多进展，奠定了现在寡核苷酸药物的基础。
  
• 2000-2006年，专注于siRNA的研发，siRNA药物的第一次繁荣在2006年，诺贝尔生理学或医学奖授予“发现小核酸RNA干扰——双链RNA引起的基因沉默机制”的两位科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛因，大药企纷纷和biotech药企合作。但很可惜，后续由于递送和免疫的问题，临床进展不佳，各大药厂退出了这个领域。
  
• 2016年以后，小核酸药物又迎来高光时刻，2018年第一个siRNA药物上市。
  
• 2021年12月22日，诺华siRNA药物Leqvio(inclisiran)获FDA批准上市，这是首款用于治疗常见慢性疾病的小核酸药物，用于需要额外降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)或杂合子家族性高胆固醇血症 (HeFH)的成人治疗。此前，Inclisiran已经在欧洲等多个国家和地区获批上市。
  

小核酸药物发展史

三.小核酸药物的递送系统

目前比较主流的核酸疗法常用以下几种递送平台技术，分别是：

• 反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides，ASOs)
  
• GalNAc配体修饰的短干扰RNA(siRNA)偶联物
  
• 脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticles，LNPs)和腺相关病毒载体(AAV vectors)
  
• 外泌体也是核酸递送平台的“种子选手”
  

这些递送技术得以临床转化的原因主要有两个：一是化学修饰技术，通过改造核酸分子提高其稳定性，并避免免疫系统的识别；二是递送载体，递送载体可以使核酸免受血清核酸酶活性和免疫成分的影响，而且可以决定药物的生物分布。
这其中更为关键的是递送载体的开发，RNAi制药领域的生物技术公司以及该领域的科研工作者从未停止新的递送技术探索，重点聚焦在GalNAc偶联和LNPs技术的研发和应用上。
1.GalNac偶联修饰

GalNac(N-乙酰化的半乳糖胺)偶联修饰，是当前最常用的小核酸药物递送系统，最近上市的三款siRNA药物均采用GalNac修饰，通过将GalNac以三价态的方式共价偶联至核酸3‘末端构成。
20世纪60-70年代，科学家们就发现乳糖可以结合肝脏表面的受体CDR，结合后会内吞，因此科学家们就利用这个特性来携带一些蛋白、多肽、小分子等等进入细胞。GalNac是结合能力最强的一种乳糖类似物，Alnylam最先使用这个方式，之后也有很多公司有了自己的GalNac平台。GalNac-ASPGR高度靶向肝细胞，递送效率很高。注：ASPGR即亚洛曲蛋白受体。



GalNAc递送系统作用特点

GalNac-siRNA偶联化合物经皮下注射后，能够迅速通过循环系统进入肝脏，后经ASPGR介导快速被肝脏细胞内吞，并在溶酶体中积聚、缓慢释放，持久不断地装载到RISC上，从而实现长效抑制作用。目前，Alnylam对GalNac的专利覆盖较为全面，涵盖GalNac-siRNA，包括双链核酸结构、限定了一些位点修饰等。Dicema主要通过构建单链结构和末尾成环等方式避开专利。除Alnylam外，近年基于GalNAc 的技术平台层出不穷，包括Dicerna的GalXC、Arrowhead的TRiM、Ionis的LICA等，驶入发展快车道。
2.脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle，LNP)

载有mRNA或siRNA的脂质纳米粒（Lipid nanoparticle，LNP）定义：球形的，粒径在10-1000mn、包含脂质成分的实心纳米粒子。由于RNA带有负电，带有正电的脂质会和它结合，形成很小的反向交错结构的粒子，外面被磷脂包裹。除了含有带负电荷的mRNA或siRNA外，LNP有四种成分：

• 可电离的阳离子磷脂(ionizable lipids)，最关键的辅料，是递送和转染效率的决定性因素，由于其比较容易被抗原呈递细胞吸收，因此常应用于疫苗；
  
• 中性辅助磷脂，中性辅助磷脂一般为饱和磷脂，可提高阳离子脂质体的相变温度，支持层状脂质双层结构的形成并稳定其结构排列；
  
• 胆固醇，有较强的膜融合性，促进mRNA胞内摄入和胞质进入；
  
• 聚乙二醇修饰的磷脂(PEGylated lipid)，位于脂质纳米粒表面，改善其亲水性，避免被免疫系统快速清除，防止颗粒聚集，增加稳定性。
  

LNP结构示意图

Arbutus是LNP的开山鼻祖，是一家专注于乙肝的小型生物制药公司，发明LNP递送技术的主要目的主要是用于乙肝RNAi药物。



LNP递送技术专利授权情况

LNP递送系统的核心壁垒是材料的专利。Arbutus公司是国际LNP领域的龙头公司，广泛且深入地覆盖了阳离子脂质及PEG脂质方面的大量专利，包括众多的化合物结构专利、LNP组合物及其配比专利和应用专利，mRNA疫苗三巨头都曾向Arbutus寻求LNP的专利授权。同时由于Arbutus专利覆盖的完整性，Moderna曾向美国专利商标局申请无效化Arbutus的部分专利，但对于US8058069号美国专利最终整体败诉，由此可以看出LNP专利对mRNA公司的重要性。
可离子化的LNP，在体内可以保持中性，从而避免被清除带来的副作用，当遇到强酸性环境时，如内吞体，即可以质子化形成阳离子从而与内源的阴离子脂质结合，提高跨膜效率。在小核酸药物递送领域，LNP还不够理想，比如：LNP的体积比较大，一般需要静脉注射；只能进入肝脏、脾脏、肿瘤等空隙比较大的组织；另外，LNP的过敏反应比较严重；同时，LNP的生产需要微流控技术，在技术和生产方面的难度较大；以上各方面，限制了LNP用在寡核苷酸药物上。

参考文献：[1] 华创证券医药团队：小核酸药物：剑指慢性病广阔市场，2022-2-17；
[2] 国金证券医药行业：技术及应用不断突破，mRNA疫苗前景广阔，2022-2-21；
[3] New modality系列(一)：寡核苷酸药物研究进展及生物学评价，B站视频网址：https://www.bilibili.com/video/BV1nq4y1P73J?spm_id_from=333.788.top_right_bar_window_history.content.click